高尔基体膜蛋白提取试剂盒

2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！

一年

WB,IP等

动物细胞/组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括蛋白酶、半蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB,IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒

1.离心管
2.吸头
3.一次性手套

使用注意事项：
 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
 使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是高尔基体蛋白回收率会下降。
 用Dounce匀浆器匀浆是高尔基体膜蛋白提取的关键的步骤，故匀浆前先通过预实验确定不同组织样本的匀浆次数，方法是每匀浆 5-10 次后，取 2-3 μl 匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到 20%以下为佳。此镜检步骤非必须步骤，但是会影响高尔基体膜蛋白的回收率。在样本极难获取的实验中，务必做镜检。
 提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
 膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
 膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。

细胞高尔基体膜蛋白提取：
1. 提取液制备：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器匀浆充分匀浆。
6. 然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
7. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
9. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
10. 在4℃，10000×g力条件下离心10分钟。
11. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
12. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。
13. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B，混匀。
14. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。
15. 弃上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，充分混匀。
16. 在2-8℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
17. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
18. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
19. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μl。
20. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高尔基体膜蛋白。
22. 将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

组织高尔基体膜蛋白提取：
1. 提取液制备：
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取50-100 mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
4. 加入500 μl冷的试剂 A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆30-40下，至无明显固体团块。
6. 然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
7. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃，3000×g力条件下离心10分钟。
9. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
10. 在4℃，10000×g力条件下离心10分钟。
11. 弃沉淀，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
12. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。
13. 在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
14. 在4℃，25000×g力条件下离心30分钟。
15. 弃上清，沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C，混匀。
16. 在4℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
17. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
18. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
19. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μl。
20. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分，即得高尔基体膜蛋白。
22. 将高尔基体膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。

1.蛋白浓度低？
处理部分样本时可能没有裂解，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂C的处理时间即可。在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

2.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.Jialin He et al.
Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells Alleviate Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury Via Golgi Apparatus Secretory Pathway Ca2+ -ATPase Isoform1
Frontiers in Cell and Developmental Biology 2020 （IF=5.201）